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TaqMan SNP Genotyping Assays는 5’ nuclease assays원리를 이용하여 한번의 PCR만으로 two allele의 SNPs를 구별하는 간단하면서도 정확한 genotyping 방법이다. 하나의 SNP를 Genotyping 하기 위해서는 두 가지 primers (forward primer, reverse primer)와 두 가지 probes (6FAM™ dye - MGB labeled probe, and VIC® dye - MGB labeled probe)가 필요하다. 각 probe는 SNP에 맞는 하나의 allele에 binding 함으로써 allele discrimination이 이루어진다.
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두 개의 PCR primers에 의해 target region이 PCR될 때, SNP에 matching 되어 결합되어 있는 probe의 5’ Reporter(FAM or VIC)가 Taq DNA polymerase 의 5’nuclease activity에 의해 cleavage된다. Release 된 FAM or VIC dye는 fluorescence 활성을 띄게 되고, 7900 realtime PCR 기기로 detection 함으로써 assays가 이루어진다. Probe가 target SNP와 mismatch가 되면 probe 가 떨어져 나가기 때문에 더 이상의 반응이 진행되지 않는다.
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Taqman assay에 사용되는 probe는 5’에 FAM or VIC fluorescence dye를 가지는 Reporter가 있고, 3’에는 Quencher와 MGB가 binding 되어 있다. MGB는 probe의 Tm값을 65-66.7도로 맞추어 5’nuclease assays 효율을 높이기 위해 사용한다.
Probe 의 길이는 13-20bp 정도로 하고, 분석하고자 하는 SNP를 가운데로 하여 design 한다. 1bp를 discrimination 해야 하므로 probe 길이는 짧을수록 좋아 최근에는 10 bp 정도로도 만들어진다.
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- X 축 : VIC dye, allele 1을 나타냄 (red color)
- Y 축 : FAM dye, allele 2를 나타냄 (blue color)
- X,Y축 가운데 :
allele1,2가 섞여진 heterotype을 나타냄
(green color)
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